【文章信息】

超细硫掺杂碳纳米颗粒增强丁酸梭菌的跨膜生物电用于产氢

第一作者：房国鑫

通讯作者：刘晓燕*、刘震*、刘宏*、周伟家*

通讯单位：济南大学，山东大学

DOI: 10.1016/j.nanoen.2023.108382

【研究背景】

相对于传统的化石燃料和热解水制氢等方法，生物制氢是一种经济高效、环境友好的替代方案。生物产氢主要包括藻类产氢、光合细菌产氢和发酵产氢。其中，暗发酵制氢工艺因其具有无须光照、产氢速率快、耗能低、微生物类群广泛且可使用多种有机底物等优势而受到广泛关注。但是暗发酵制氢技术尚未完全成熟，在提高产氢率、增强制氢稳定性、实现规模化应用等方面仍面临巨大挑战。因此，本文深入研究了硫掺杂碳纳米颗粒对丁酸梭菌产氢性能的调控。碳和硫元素不仅是暗发酵菌在产氢过程中维持代谢所需的营养物质，还是形成氢化酶或其他酶的重要成分。

【文章简介】

近日，济南大学刘宏教授和周伟家教授团队在国际著名期刊Nano Energy上发表了题目为“Ultrafine sulfur–doped carbon nanoparticles enhanced the transmembrane bioelectricity of Clostridium butyricum for biohydrogen production ”的文章。通过简单的激光辅助合成法制备了富电荷的超细硫掺杂碳纳米颗粒（SCNPs），将超细SCNPs与丁酸梭菌共孵育以构建一种无机-生物杂化体系。超细SCNPs同时聚集在丁酸梭菌的细胞表面和细胞周质中，改善了SCNPs与细菌氢化酶的相互作用，提高了SCNPs与氢化酶之间的电荷转移效率，有效提高了丁酸梭菌的产氢性能。此外，该工作还发现了丁酸梭菌的降解能力，该杂化体系对甲基橙的降解效率可在12 h内达到90%以上。这项工作为无机-生物杂化体系的设计提供了新的思路，有助于阐明其分子生物学复杂性。

【本文要点】

要点一. 硫掺杂碳纳米颗粒（SCNPs）表征

图1 （a）CNPs和（b）SCNPs的TEM图像（插图：CNPs和SCNPs的HRTEM图像），（c）CNPs和SCNPs的S 2p的精细光谱，（d）SCNPs和CNPs的拉曼光谱，（e）SCNPs和CNPs水化直径分布直方图（插图：CNPs和SCNPs悬浮水溶液的Tyndall效应照片），（f）SCNPs和CNPs的Zeta电位直方图。

如图1，TEM图像表明SCNPs和CNPs具有几乎相同的形态特征，单个纳米颗粒呈准球形，平均粒径为12 nm, S掺杂后形貌和尺寸变化不明显。在高分辨率透射电子显微镜（HRTEM）图像中，SCNPs和CNPs都具有洋葱状结构，由富勒烯型石墨多壳碳纳米颗粒组成。SCNPs保留了多层同心碳结构的结构特征，碳层厚度为0.30 nm，与CNPs（0.32 nm）无显著差异。EDS-mapping和XPS分析证实了S物种在SCNPs中成功掺杂。拉曼光谱显示SCNPs的D峰与G峰的强度比（I_D/I_G）为1.12，远大于CNPs的强度比（0.86），表明硫掺杂导致纳米颗粒的结构紊乱，缺陷增多。动态光散射（DLS）测量表明，SCNPs的水化粒径主要分布在10~20 nm范围内，这证明颗粒具有良好的分散性和动力学特性。掺杂S后，SCNPs的Zeta电位从−39.5 mV（CNPs）增加到−48.9 mV。因此，具有负Zeta电位的碳纳米颗粒在与细菌孵育的培养环境中趋于电稳定。

要点二. SCNPs与丁酸梭菌的生物相容性评价

图2 （a）与CNPs和SCNPs共孵育的细菌在黑暗中形成的菌落照片，（b）用平板计数法测定与SCNPs共孵育的细菌的相对细菌存活率，误差条表示至少三个独立实验的平均值±标准差，（c）原始菌、与CNPs共孵育的细菌以及与SCNPs共孵育的细菌的总蛋白质的SDS-PAGE分析，（d-f）未添加SCNPs和添加SCNPs的野生型细菌荧光成像，PI和Syto 9染色（绿色为活细胞，红色为死细胞）。

用经典平板计数法和SDS-PAGE分析表明CNPs和SCNPs具有较高的生物相容性，共孵育的丁酸梭菌蛋白质条带的位置和亮度没有显著差异。随后，用碘化丙基（PI）和Syto 9荧光染色检测细胞膜的完整性。对于所有用SCNPs和CNPs处理过的细菌在荧光检测时呈现出明显的绿色信号证实了SCNPs具有优异的生物相容性和低细胞毒性。

要点三. 与SCNPs共孵育的丁酸梭菌的产氢性能评价

图3 （a）可见光和黑暗条件下原始的SCNPs和细菌的产氢情况，（b）不同硫掺杂量的SCNPs用于暗发酵产氢情况，（c）加入不同SCNPs量孵育的细菌的暗发酵产氢情况，（d）原始菌、与CNPs共孵育的细菌以及与SCNPs共孵育的细菌的连续发酵产氢情况，（e）原始菌、与CNPs共孵育的细菌以及与SCNPs共孵育的细菌产氢情况，（f）原始菌和SCNPs共孵育菌对甲基橙的产氢率和降解率。误差条表示至少三个独立实验的平均值±标准差。

通过丁酸梭菌与CNPs和SCNPs共孵育，研究了丁酸梭菌在生物杂化体系中产氢的过程。对于相同数量的细菌，当添加0.4 g/L 5.6 wt%的SCNPs时，H₂的产量最高。对于优化后的SCNPs和丁酸梭菌的生物杂交系统，连续监测产氢12h，在不添加额外能源的情况下，生物混合系统的产氢量在12h内呈线性增加。在黑暗条件下，原始菌在12h的产氢量为347.05±30.82 μmol/g，而SCNPs与细菌的生物杂交体系的产氢量为4354.99±43.96 μmol/g，是原始菌的12.5倍左右。这些结果表明，SCNPs与丁酸梭菌的杂交生物系统可以稳定而有效地生产H₂。硫是暗发酵菌在产氢过程中维持代谢所需的营养物质，也是氢化酶的重要组成部分。硫的引入可能会加速细菌的代谢，提高氢化酶的活性，这可能是SCNPs能更好地促进丁酸梭菌产氢效率的原因。以甲基橙（MO）代替葡萄糖进行发酵过程，研究与SCNPs共孵育的丁酸梭菌在产氢同时的降解效率。从图3f可以看出，随着时间的推移，与SCNPs共孵育的细菌对MO的降解效率比原始菌提高得快得多。与SCNPs共孵育的细菌对MO的降解效率高达90.20%，远高于原始菌（≈22.30%）。同时，与SCNPs共孵育的细菌的产氢效率没有下降（391.70µmol/g/h）。对比上述结果，SCNPs-丁酸梭菌杂化体系具有较好的产氢能力和MO降解能力，碳和硫元素的加入将促进细菌代谢和其他生命活动。在这种情况下，丁酸梭菌能够保持高效的生存能力可能是由于纳米颗粒具有良好的生物相容性，从而提高了电荷转移效率。

要点四. 丁酸梭菌对纳米颗粒的吸收及细胞外电荷传导

图4 （a，b）原始菌和与SCNPs共孵育的细菌的TEM图像，（c，d）原始菌和与SCNPs共孵育的细菌的横切面TEM图像，（e，f）原始菌和与SCNPs共孵育的细菌的AFM图像（插图分别为相应的高度剖面）。

进一步探讨了SCNPs提高丁酸梭菌产氢率的潜在机理。原始细菌的轮廓相对平滑均匀，而与SCNPs孵育6 h后的细菌图像显示明显的黑点（由红圈所标识），说明SCNPs特异性附着在细胞表面。除了原始菌中观察到的与内在成分相对应的小黑点外，在与SCNPs共孵育的细菌细胞中，包括周质、细胞质、外膜和内膜（绿色圆圈所指向），观察到大量额外的略大的黑点。这些较大的黑点被认为是SCNPs颗粒在细胞器周围的聚集和组装。AFM图像显示，原始菌的长度约为2.6 μm，高度约为0.5 μm，而与SCNPs共孵育的细菌的长度约为2 μm，高度约为0.7 μm。与SCNPs共孵育的细菌的表面粗糙度约为12.8 nm，高于原始菌（Rq≈7.2 nm, Rq:均方根粗糙度）。脱水细胞的不同粗糙度可以反映细胞外表面的轮廓，以及细胞内颗粒或其团簇，这些都表明丁酸梭菌细胞对SCNPs的有效摄取。

图5 与SCNPs共孵育的细菌的丁酸梭菌的电导率：（a，b）裸菌和与SCNPs共孵育的细菌的表面电位图像，（c，d）裸菌和与SCNPs共孵育的细菌的接触电流图像。

为了研究电子传导途径，通过KPFM测试了原始菌和与SCNPs共孵育的细菌的表面电位。在SCNPs存在的情况下，丁酸梭菌表面电位达到1.4 V，而原始细菌表面电位仅为349.8 mV。另一方面，细菌/SCNPs复合物的接触电流也通过峰值力-TUNA模型进行原位测量，裸露的细菌导电性较差，能够测量到接触电流的区域仅分布在细菌膜的边缘，这可能是探针的挤压引起的。在与SCNPs共孵育的细菌上，电流均匀地流过膜表面，表现出增强的电导率。这说明了SCNPs和丁酸梭菌之间的紧密连接，这对电子传导至关重要。基于上述结果，我们推测导电纳米颗粒富集了细菌膜的表面电荷，促进了SCNPs辅助下细菌内部电子的跨膜传导，最终提高了细菌的导电性。

要点五. SCNPs-丁酸梭菌杂交系统的代谢及增强机制

图6 （a）原始菌和与SCNPs共孵育的细菌中丙酮酸的紫外吸收光谱，（b）原始菌和与SCNPs共孵育的细菌中丙酮酸的浓度随时间的变化，（c）混合体系中析氢增强的机理示意图。

基于上述结果，提出了一种混合系统增强产氢机理。（Ⅰ）当SCNPs与丁酸梭菌共孵育时，SCNPs丰富的表面电荷可以与生物活性成分相互作用并整合到产氢途径中。部分电子可能参与糖酵解过程，导致形成更多的丙酮酸。（Ⅱ）丙酮酸的额外积累进一步导致了更高的丁酸浓度，这为丁酸解氢酶的产氢途径提供了更丰富的底物。另一部分电子增强了氢化酶的活性。（Ⅲ）细菌周质中的氢化酶是关键酶，部分SCNPs被吞噬进入细菌，电子通过氢化酶中的[Fe-S]簇迅速转移到活性中心（H簇），大大缩短了电子转导途径，减少了跨膜扩散过程中的能量损失，提高了细菌细胞中电子转导的效率，从而促进H⁺还原和H₂的生成。此外，电子丰度可以提高细胞内NADH/NAD⁺比值，有利于产氢。最后，硫不仅是微生物代谢的必要营养素，提高了丁酸梭菌的代谢率，而且负载的硫元素可以激发[Fe-S]团簇和[Ni-S]团簇的催化活性，进一步提高了催化产氢的效率。因此，所有的效应共同作用，导致氢气的析出。

【文章链接】

Guoxin Fang, Ying Hou, Tao Qiu, Yuke Chen, Wanqiang Yu, Xiaoyan Liu*, Zhen Liu*, Jianquan Shen, Hong Liu*, Weijia Zhou*. Ultrafine Sulfur–Doped Carbon Nanoparticles Enhanced the Transmembrane Bioelectricity of Clostridium Butyricum for Biohydrogen Production. Nano Energy, 2021, 106302, https://doi.org/10.1016/j.nanoen.2021.106302.

【通讯作者介绍】

刘宏教授，济南大学前沿交叉科学研究院院长，山东大学晶体材料国家重点实验室教授，博士生导师，国家杰出青年科学基金获得者。中国硅酸盐学会晶体生长分会理事，中国光学学会材料专业委员会会员理事，中国材料研究学会纳米材料与器件分会理事。主要研究方向：生物传感材料与器件、纳米能源材料、组织工程与干细胞分化、光电功能材料等。十年来，主持了包括十五、十一五、十二五863、十三五国家重点研发项目和自然基金重大项目、自然基金重点项目在内的十余项国家级科研项目，取得了重要进展。2004至今，在Adv.Mater., Nano Lett., ACS Nano, J. Am. Chem.Soc等学术期刊上发表SCI文章400余篇，总被引次数超过26000次，H因子为78，30余篇文章）入选高被引论文。2015和2019年度进入英国皇家化学会期刊“Top 1% 高被引中国作者”榜单。2018至2022连续五年被科睿唯安评选为“全球高被引科学家”。授权专利30余项，研究成果已经在相关产业得到应用。2019年获得山东省自然科学一等奖。

周伟家教授，济南大学前沿交叉科学研究院副院长，博士生导师，学术带头人。主要从事能源催化和功能器件相关研究，在氢能源、二氧化碳资源化和催化电池等方面取得一系列研究成果，以第一或通讯作者在Energy Environ. Sci, Angew. Chem. Int. Ed., Adv. Energy Mat.等期刊发表SCI收录论文100余篇，被他引15000余次，H因子60，中国百篇最具影响力国际学术论文1篇，ESI高被引用论文11篇；中国化学快报、物理化学学报、BMEmat、SusMat期刊的青年编委、交叉学科材料学术编辑和ECS Sensors Plus顾问编；授权发明专利16项。主持国家优秀青年基金（2020），山东省杰出青年基金（2021），山东省泰山学者青年专家计划（2019），山东省重点研发计划（2019）等国家省部级项目12项。获得山东省青年科技奖（2022）、山东省自然科学一等奖（3/5，2019）和中国颗粒学会自然科学二等奖（1/5，2022）。

刘晓燕副教授，济南大学前沿交叉科学研究院副教授，硕士生导师。2013年毕业于山东大学晶体材料国家重点实验室，获材料学博士学位。2013年到2019年在广东省半导体产业技术研究院工作，主要从事半导体器件研发及微纳加工技术研究。2019年9月入职济南大学，主要从事微纳加工技术在新型能源以及生物诊疗技术方面的研究。主持山东省自然科学基金1项，作为子项目负责人主持2项广东省应用研发专项和1项山东省自然科学基金联合基金项目，作为项目骨干参与1项国家重点研发计划。在Small、Chemical Engineering Journal等期刊等发表SCI论文近20篇。申请发明专利40余件，其中授权20余件，在微纳加工技术及器件开发及应用方面积累了丰富的经验。

刘震，山东大学博士，现济南大学前沿交叉科学研究院讲师。主要研究方向为敏感光电材料在能源催化及分析传感器件的应用。在Nanno energy，Nano-Micro Letters，Biosensors and Bioelectronic，Sci. Rep.等发表多篇论文。主持山东省自然科学青年基金，参与重大科学仪器专项，重大基础研究基金子课题等项目。

【第一作者介绍】

房国鑫，济南大学前沿交叉科学研究院，2020级硕士研究生。主要研究方向为纳米材料在微生物调控中的应用。以第一作者在Nanno Energy发表论文一篇。

【课题组介绍】

济南大学前沿交叉科学研究院简介：

前沿交叉科学研究院：济南大学为了适应科研和教育的快速发展，推进国务院提出的世界一流大学和一流学科建设，于2016年投资筹建的具有鲜明学科交叉特色、适应国际前沿交叉科学研究趋势的独立研究机构。前沿交叉科学研究院将以学科交叉与学科融合为研究特色，以新型医药和现代能源核心技术为研发目标，在生物传感与再生医学、可再生能源转化高效利用和信息材料等相关领域开展基础和应用基础研究。以重大原始创新为驱动，以微纳传感、生命组织重建及纳米能源材料等重大核心技术突破及其在癌症早期诊断、组织修复、环境保护和新能源等领域的应用为牵引，带动和促进相关技术的转移转化与产业化，成为原始创新基地和高水平创新人才培养摇篮承担国家重大科研项目。研究院根据学科布局和研究目标，目前设立微纳传感与组织工程、微纳能源材料与器件、信息材料与器件等研究方向，并将设立微纳材料制备、微纳材料表征、环境与生物等研究平台，并将成立相关省级研究平台支撑交叉学科的建设。

研究院以刘宏教授为首席科学家，借助“山东泰山学者”、“济南大学龙山学者”等主要人才计划支持，吸引和凝聚海内外一流的创新人才，建设一支高水平富有活力的国际化创新团队。学院通过在全球范围内广招贤士，汇聚不同专业的研究人才，在较短时间内建成具有国际影响的研究基地，形成了骨干成员20余名的高水平的交叉学科研究团队，团队成员的专业构成有材料学、化学、化工、能源、生物、物理微电子等，其中国家杰青、国家优青、泰山学者、广东省杰青、山东省优青等青年人才10余名。研究院已经建成了包括场发射扫描显微镜、XRD、共聚焦扫描显微镜、拉曼光谱仪等测试表征设备和各种沉积设备、材料制备设备及微加工设备等在内的高水平研究测试平台。

新能源材料与传感器件团队简介：

依托于济南大学前沿交叉科学研究院，组建“新能源材料与传感器件”研发团队，由教授3人、副教授2人，讲师4人，博士后1人，博士生10人，硕士生33人组成。团队利用微纳加工、激光合成和电化学三大技术，在能源与传感两大方向开展应用基础研究。能源方向专注于氢能源、碳循环和氮循环，利用激光等物理信号调制的催化反应和器件系统在新能源和环境领域的相关研究。